04-165-MOLLINEDA-RODRIGUEZ-GONZALEZ-VALDES-HERNANDEZ-ALFONSO-VALDES

Rev. Mar. Cost. ISSN 1659-455X. Vol. 8 (1): 51-62, Enero-Junio 2016.

DOI: http://dx.doi.org/10.15359/revmar.8-1.4

Actividad fotoprotectora y fotorreparadora de los extractos de las angiospermas marinas, Thalassia testudinum Banks ex König (Hyrocharitacea) y Syringodium filiforme Kützing (Cymodoceaceae)

Photoprotective and photorepair action of marine angiosperm extracts, Thalassia testudinum Banks ex König (Hyrocharitacea) and Syringodium filiforme Kützing (Cymodoceaceae)

Adrián Fagundo Mollineda1*, María Rodríguez García1, Kethia L. González García2, Olga Valdés Iglesias2, Yasnay Hernández Rivera2, Ángel R. Concepción Alfonso3 y Odalys Valdés Martínez4

1 Departamento de Farmacología, Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR), Loma y 37. Nuevo Vedado, Ciudad Habana, Cuba. CP. 10600; adrian@cip.alinet.cu*, maria@cebimar.cu

2 Departamento de Química, Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR), Loma y 37. Nuevo Vedado, Ciudad Habana, Cuba. CP. 10600; kethia@cebimar.cu, ovaldes295@gmail.cu, yasnay@cebimar.cu

3 Instituto Superior de Ciencias Médicas “Victoria de Girón”; aconce@giron.sld.cu

4 Departamento de Control Biológico del CIDEM; odalys.valdes@cidem.sld.cu

Recibido: 22 de mayo de 2015

Corregido: 27 de junio de 2015

Aceptado: 21 de noviembre de 2015

RESUMEN

Estudios realizados con Thalassia testudinum y Syringodium filiforme han demostrado que estas plantas poseen un alto contenido de polifenoles y una marcada actividad antioxidante. Este estudio describe el efecto tópico de los extractos de estas plantas contra el daño agudo inducido por la radiación ultravioleta B (UVB). Las fanerógamas empleadas fueron recolectadas a 3-4 metros de profundidad en el noroeste de La Habana. Para la administración de los tratamientos se crearon cinco grupos experimentales. El efecto de los extractos fue evaluado in vivo, irradiando la piel de la región dorsal de ratones albinos con radiación UVB (dosis: 1.21x103 Jxcm2) por seis minutos. Antes o después de la radiación UVB los animales recibieron tratamiento tópico con los extractos de ambas angiospermas a dosis de 500 µg x cm2 de piel. Se observaron diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los grupos T. testudinum, S. filiforme y los “irradiados” y “placebo”. Los extractos de T. testudinum y S. filiforme reducen el daño macroscópico causado por la radiación UVB en las pieles irradiadas en los modelos de tratamiento preventivo y de fotodaño. Además, mostraron un efecto protector y reparador del daño inducido por las radiaciones UVB, lo que podría estar relacionado con su actividad antioxidante.

Palabras claves: Thalassia, Syringodium, radiación, fotoprotección, piel.

ABSTRACT

Previous studies with the aqueous-ethanol extracts obtained from the marine angiosperms T. testudinum and S. filiforme have shown their high polyphenolic content and marked antioxidant capacity. This study describes the effects of the topical application of the aqueous-ethanol extracts of T. testudinum and S. filiforme leaves against acute UVB-induced damage. The phanerogams used were collected 3-4m deep in La Habana’s northwestern coast. Five experimental groups were created for the administration of the treatment. The effect was evaluated in in vivo assays, radiating the skin of the dorsal region of albino mice with UVB (dose: 1.21x103 Jxcm2) for six minutes. Before or after UVB irradiation, animals received topical treatment with the extracts at doses of both angiosperms 500μg x cm2 on their skin. Significant differences were observed (P ≤ 0.05) between groups: T. testudinum, S. filiforme, irradiated subjects, and “placebo”. T. testudinum and S. filiforme extracts reduce macroscopic damage caused by UVB radiation in irradiated skins on preventive and photodamage models. In addition, these extracts show protective and repair effects against UVB radiation damage, which could be related to their antioxidant action.

Keywords: Thalassia, Syringodium, radiation, photoprotection, skin.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, la incidencia de diversas enfermedades y los trastornos en la piel relacionados con la radiación solar ultravioleta (UV) han aumentado drásticamente y continúan creciendo (Mora et al. 2010). La reducción en la concentración del ozono en la estratosfera ha conllevado a la exposición inadvertida a las radiaciones ultravioletas A y B (Bickers, 2004; Sánchez, 2006). La exposición crónica de la piel a la radiación ultravioleta induce respuestas biológicas como quemaduras solares, eritema, edema, fotoenvejecimiento, entre otras (Karol, 2009; Narayanan et al. 2010), además, afecta los componentes de la epidermis y la dermis. Por consiguiente, se hace muy necesaria la búsqueda de nuevos compuestos que actúen como atenuantes de los efectos nocivos de las radiaciones solares a las cuales es inevitable exponerse aunque sea de manera ocasional.

La plataforma insular cubana está cubierta por una gran cantidad de praderas de pastos marinos en los que abundan las especies de angiospermas marinas Thalassia testudinum Banks ex König y Syringodium filiforme Kützing, que admitirían una explotación sostenible y ofrecen amplias posibilidades de seleccionar plantas con posible aplicación biomédica sin provocar daños a los ecosistemas, donde se desarrollan estos. Por la importancia del tema se decidió realizar el estudio comparativo de los efectos beneficiosos de los extractos de T. testudinum y S. filiforme en el daño agudo inducido por la radiación UVB en la piel.

T. testudinum presenta actividad antiinflamatoria, antioxidante, estimula el crecimiento del pelo y posee una marcada actividad dermoprotectora (Aneiros et al. 2003). La actividad dermoprotectora de dicha planta puede deberse a la gran cantidad de polifenoles presentes en ella (Regalado et al. 2009), los cuales pueden tener una elevada actividad antioxidante (Regalado et al. 2012), confiriéndole a la planta, junto a otros factores, su actividad dermoprotectora. S. filiforme ha resultado muy poco estudiada hasta la actualidad, por lo que no sobresalen muchos resultados sobre esta, solo Zapata & Mc Milan (1979), Mc Milan & Zapata (1980) y recientemente Nussier et al. (2010) y González et al. (2011) han estudiado la planta desde el punto de vista químico. Por los aspectos vistos anteriormente se planteó el objetivo de determinar la acción de los extractos de Thalassia testudinum y Syringodium filiforme como dermoprotectora y reparadora del daño en pieles sometidas a la aplicación de radiación ultravioleta B.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material de ensayo, recolecta y procesamiento: Las angiospermas marinas T. testudinum y S. filiforme fueron recolectadas a 3-4 metros de profundidad en el Rincón de Guanabo, La Habana, Cuba (23º 11ʼ 12ʼʼ N; 82º 06ʼ 28ʼʼ O), en el mes de noviembre del 2012. Una vez recolectados los ejemplares de ambas especies fueron secados en estufa a 60°C por 48 horas y se conservaron en bolsas de nailon.

Extracción: El material seco fue sometido a un proceso de maceración con etanol-agua (50:50, vol/vol) por siete días a temperatura ambiente. Los extractos fueron filtrados y concentrados al vacío.

Animales y tratamientos: El número de animales utilizados en los experimentos fue el mínimo requerido para la interpretación estadística de los datos. Se emplearon ratones Balb/C machos, con un peso promedio entre 22-24 g, adquiridos en el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Cuba).

Los animales fueron depilados 48 h antes del ensayo en la zona dorsal (2 x 2 cm), con la crema Veet (Francia), posteriormente fueron separados en grupos experimentales, de seis animales cada uno y colocados en cajas individuales. Antes de aplicar la radiación se anestesiaron los animales con pentobarbital sódico (83.3 mg•kg-1 de peso). La radiación UVB (1.21x103 Jxcm2) se aplicó por seis minutos a una distancia de 15 cm de la lámpara de acuerdo con los esquemas de tratamientos (Fig. 1). Las pieles fueron examinadas macroscópicamente. Se aplicó una puntuación entre 1-4 para poder calificar el grado de daño observado, donde 1 representa el nivel mínimo de daño en la zona irradiada y en el grado 4 (nivel máximo de daño) se observan eritema, edema y lesiones costro-descamativas (Regalado et al. 2009).

Al final de los ensayos se aplicó eutanasia mediante tracción cervical y se tomaron muestras para el estudio histopatológico de las pieles.

Estudio histopatológico: Las muestras de piel (2 cm) fueron fijadas en formalina al 4% por 24 h e incluidas en parafina. Posteriormente, se realizaron cortes de 4 µm a los que se aplicaron las tinciones de hematoxilina-eosina (H&E) y de Van Geison para su caracterización. Las láminas se evaluaron de forma codificada y las observaciones se realizaron en un microscopio óptico.

Análisis estadístico de los resultados: Para el análisis estadístico de los datos se emplearon las pruebas Kolmogorov-Smirnov y U de Mann Whitney con una P < 0.05 (SPSS, 2006).

RESULTADOS

Efecto protector de los extractos de T. testudinum y S. filiforme frente al daño inducido por radiaciones UVB

Las pieles no protegidas (“irradiados” y “placebo”) expuestas a las radiaciones UVB presentaron manifestaciones macroscópicas del daño, tales como: eritema, inflamación y lesiones costro-descamativas (Rodríguez et al. 2010). Sin embargo, en las pieles tratadas 30 min antes de recibir la radiación UVB, con formulaciones que contienen los extractos de T. testudinum y S. filiforme en dosis de 500 μg•cm-2, no se observaron dichas alteraciones macroscópicas o comportamiento similar al grupo FPS-50 (control positivo). En la Figura 2 se puede observar que los resultados a partir de grupos tratados con los extractos de T. testudinum y S. filiforme difieren significativamente (U de Mann Whitney P <0.05) de los mostrados por los grupos “irradiados” y “placebo”, no así para los resultados mostrados por el grupo FPS-50.

Los efectos inhibitorios macroscópicos de los extractos de T. testudinum y S. filiforme fueron confirmados con los estudios histopatológicos, así en las pieles no tratadas se observan alteraciones como: acantosis, hiperqueratosis, congestión de los vasos sanguíneos, presencia de macrófagos e infiltrado inflamatorio, ruptura y desorganización de las fibras colágenas (Fig. 3). Sin embargo, en los animales pretratados (30 min antes) con FPS-50 o los extractos crudos de T. testudinum y S. filiforme no se observaron o fueron mínimas la acantosis e hiperqueratosis, además de no detectarse daño vascular ni destrucción de las fibras colágenas (Fig. 4).

Evaluación del efecto reparador del fotodaño agudo inducido por radiaciones UVB mediante las observaciones macroscópicas de las pieles

En el modelo de Tratamiento Reparador, la radiación UVB provocó alteraciones macroscópicas en los ratones irradiados con y sin tratamiento y se observó la presencia de eritema, inflamación y en algunos casos lesiones costro-descamativas. Los efectos de los extractos de T. testudinum y S. filiforme sobre las alteraciones macroscópicas en la piel de animales irradiados con luz UVB después de siete días de tratamiento tópico fueron evidentes, pues la piel de los animales se notaba con un alto grado de recuperación. El análisis estadístico demuestra que no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados con extractos y el control positivo (crema UF) (Fig. 5).

Análisis de los resultados histopatológicos de la evaluación del efecto reparador de los extractos posterior al daño inducido por radiaciones UVB

Con el estudio histopatológico de las pieles (Fig. 6), se pudo observar que, al igual que en el ensayo anterior, en las pieles no tratadas aparecieron alteraciones histopatológicas como: acantosis (engrosamiento de la epidermis por hiperplasia e hipertrofia de las células de la epidermis) y hiperqueratosis (engrosamiento de la capa córnea por acumulación de la queratina). Además, con la tinción aplicada (Hematoxilina y Eosina) se pudo observar la infiltración de células inflamatorias y congestión de los vasos sanguíneos.

En la Figura 7, mediante la tinción de Van Gieson, se observa la ruptura y degradación de las fibras colágenas en los grupos “irradiados” y “placebo”, respectivamente. Los grupos control positivo (UF) y los tratados con los extractos de ambas angiospermas muestran similitud a las pieles de animales sanos (control).

DISCUSIÓN

Las evidencias muestran que el fotodaño agudo inducido por UVB se caracteriza, entre otros aspectos, por la degradación del colágeno y la acumulación anormal de la elastina en la dermis superficial. La radiación UV causa la rotura del colágeno a mayor velocidad que el envejecimiento cronológico (Fisher et al. 2009). Los mastocitos y los macrófagos se encuentran en gran número en las pieles fotodañadas y han sido relacionados con estos procesos. Además, en las pieles dañadas hay inflamación y puede haber hemorragia porque la hemoglobina puede ser liberada de los hematíes (Trautinger, 2001).

Con los resultados obtenidos en este trabajo se pudo demostrar que el esquema de Tratamiento Preventivo fue válido para estudiar el efecto protector ante el daño producido en la piel por la luz UVB de los extractos, al menos aplicando el extracto 30 min previos a la radiación. Se pudo observar que no existen diferencias significativas entre los grupos experimentales en los cuales se aplicaron los extractos de T. testudinum y S. filiforme, por lo que se puede afirmar que ambos extractos poseen efecto preventivo ante las radiaciones UVB, al menos con este modelo.

En el modelo de Tratamiento Reparador, los grupos tratados con los extractos de T. testudinum y S. filiforme y con la crema UF utilizada como control positivo, los animales presentaron una reducción gradual de las lesiones macroscópicas hasta alcanzar la recuperación total (grado 1). Sin embargo, los animales de los grupos “irradiados” y “placebo” mostraron diferencias significativas con los grupos tratados con los extractos y con el grupo UF, ya que persistieron las afectaciones visibles a simple vista (grados 3 y 4). Estos resultados demostraron que las formulaciones que contienen los extractos de las angiospermas exhibieron la capacidad de reparar el daño, al menos macroscópicamente, provocado por las radiaciones UVB (Fig. 4). Los efectos macroscópicos de los extractos solo son el reflejo de la acción de estos actuando a nivel celular y molecular.

El estudio histopatológico de las pieles pretratadas es consistente con lo descrito anteriormente en la literatura acerca del daño inducido por las radiaciones UVB (Liou & Campbell, 1995; Seité et al. 2010), ya que en los grupos “irradiados” y “placebo” apareció acantosis por el incremento en el grosor de la epidermis, producto de la hiperplasia e hipertrofia de las células de la capa basal de esta estructura, también fue evidente la aparición de células indicativas del proceso inflamatorio como son mastocitos y neutrófilos, así como la aparición de congestión en los vasos sanguíneos que en ocasiones se rompen (Fig. 3). Adicionalmente, se observó ruptura y desorganización de las fibras colágenas. Sin embargo, como se muestra en la Figura 4, los haces de fibras colágenas aparecen paralelos a la epidermis como en las pieles sanas en los grupos pretratados con extracto de T. testudinum, S. filiforme y con el FPS-50.

El análisis histopatológico de las pieles fotodañadas a las que se les aplicó el esquema de Tratamiento Reparador (Figs. 6 y 7) mostró que en las pieles irradiadas y placebos persisten las alteraciones como acantosis e hiperqueratosis, producto del daño en estos grupos no tratados. Además, en las pieles tratadas con los extractos de ambas angiospermas marinas no se observó la ruptura y desorganización de las fibras colágenas, afectación que está marcada en el grupo irradiado, por lo que es posible pensar que los mecanismos de degradación de la proteína pudieron ser inhibidos o al menos reducidos, no permitiendo la ruptura de los haces de fibras. Al mismo tiempo, el incremento de fibroblastos sugiere que los extractos de T. testudinum y S. filiforme contribuyen a la reparación del daño en la piel por el incremento de la síntesis de colágeno (Svobodová et al. 2003; Regalado et al. 2009). Y por la existencia en ellos de polifenoles y flavonoides encontrados por Regalado et al. (2009; 2012) y González et al. (2011). Estas familias de metabolitos poseen propiedades fotoprotectoras sobre la piel que han sido demostradas por Choquenet et al. (2008).

La acción protectora y reparadora del daño inducido por la radiación UVB, mostrada por los extractos de T. testudinum y S. filiforme en la piel como tejido, solo puede ser posible por la acción que deben estar teniendo dichos extractos a nivel celular y molecular, ya que como se ha expuesto anteriormente el mecanismo de acción de los rayos UVB sobre la piel sienta sus bases en dichos niveles.

Los extractos de T. testudinum y S. filiforme reducen el daño macroscópico causado por la radiación UVB en las pieles irradiadas en los modelos de tratamiento preventivo y de fotodaño.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la colaboración de José Ramón García, especialista en buceo de CEBIMAR, por la recolección de la especie y posterior conservación hasta su estudio, a Teresita del Vallín por el desempeño en el estudio histopatológico realizado y a los evaluadores por sus valiosas observaciones.

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