Revisando los fundamentos del análisis de p-nitrofenol para su aplicación en la cuantificación de la actividad de lipasas. Una actualización gráfica.
DOI:
https://doi.org/10.15359/ru.34-2.2Palabras clave:
p-nitrofenol, lipasa, absorbancia dependiente del pH, disociación dependiente de la temperatura, espectro 3D de absorbancia, pH, longitud de ondaResumen
El p-nitrofenol (pNP) es un compuesto ampliamente utilizado para la determinación analítica de esterasas (EC. 3.1.1.X), incluidas las lipasas (E.C. 3.1.1.3). La mayoría de las mediciones enzimáticas emplean sus derivados, tales como ésteres, que se descomponen por hidrólisis, liberando pNP que se cuantifica por su absorbancia a 410 nm. Aunque, este tipo de métodos se desarrolló hace algunas décadas, el análisis espectrofotométrico de pNP requiere mediciones precisas de pH y temperatura, para lograr determinaciones confiables. El objetivo de este trabajo es ofrecer una actualización gráfica de cómo el pH y la temperatura afectan la absorbancia de p-nitrofenol a diferentes longitudes de onda en medios emulsionados para ensayos con lipasas, debido a su relevancia para la determinación cuantitativa de la actividad de las lipasas bajo métodos espectrofotométricos. Para resaltar la importancia de cada variable en este análisis, se disolvió pNP en medios emulsionados (para la cuantificación de la actividad de la lipasa) a varios valores de pH de 4.00 a 11.00 y se midió su absorbancia en un rango de 270 nm a 500 nm a varias temperaturas en el rango de 25 °C a 50 °C. El comportamiento químico de pNP bajo estas condiciones se correlacionó mediante la construcción de gráficos tridimensionales. Como resultado, los gráficos 3D construidos experimentalmente, mostraron que, independientemente de la temperatura, por debajo de pH 6.00 el pNP absorbe principalmente, a 317 nm, debido a la mayor abundancia de su forma protonada que es completamente predominante a pH 3.50 e inferiores. Por otro lado, a pH 10.0 y superiores, el equilibrio se desplaza completamente a la forma aniónica pNP, que absorbe a 410 nm. Nuestros datos confirman que en valores de pH cercano a la neutralidad, el pNP muestra un efecto de dependencia a la temperatura, aumentando la absorbancia a 410 nm a temperaturas más altas. Debido a muchas determinaciones cuantitativas de las actividades enzimáticas, el pNP se libera en un medio de reacción de alrededor de pH 7.00. Es necesario recordar el papel determinante del pH y la temperatura sobre estas mediciones y cómo estas variables deben ser estrictamente consideradas.
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